本文刊于：岭南心血管病杂志，，27（01）：21-26
作者：薄雅坤，骆小梅，王贵鹏
通讯作者：王贵鹏
摘要目的
探索维吾尔族（维族）心房颤动患者ABCA1基因CT位点多态性与达比加群酯治疗效果的关系。
方法
选取年1月至年12月在新疆医院住院或门诊就诊的维族、汉族心房颤动患者例作为研究对象。检测入选患者的ABCA1基因CT位点多态性，再分别检测并比较不同基因型患者达比加群酯治疗后的血药浓度、凝血指标和出血事件。
结果
维族患者共73例，CT位点CC、CT、TT基因型分别占31.5%、49.3%、19.2%，C和T等位基因分别占56.2%、43.8%，与汉族患者在该位点的基因型和等位基因频率比较，差异无统计学意义（P0.05）。达比加群酯治疗后，TT组患者的血药峰浓度和谷浓度最高，分别为（.48±40.04）mg/L和（42.15±7.74）mg/L，CT型组次之，CC型组最低，且差异具有统计学意义（P0.）。服用达比加群酯4d后，患者凝血指标发生显著性变化（P0.01），其中TT型组活化部分凝血酶时间（APTT）显著高于CT型组[（39.43±5.09）svs.（34.21±4.92）s，P0.01]和CC型组[（39.43±5.09）svs.（33.91±4.07）s，P0.01]，差异有统计学意义，治疗前后变化率为0.33±0.17；TT型组凝血酶时间（TT）显著高于CC型组（P0.01），与TC型组比较差异无统计学意义（P＞0.05），治疗前后变化率达4.55±2.85；而凝血酶原时间（PT）、凝血酶原时间变化率、国际标准化比值（INR）和国际标准化比值变化率在不同基因型患者中比较，差异无统计学意义（P0.05）。不同基因型的心房颤动患者在达比加群酯治疗期间的出血事件发生率比较，差异无统计学意义（P0.05）。
结论
维族和汉族ABCB1基因CT基因型和基因频率均无显著性差异。CT多态性影响维族心房颤动患者口服达比加群酯后的血药浓度和凝血指标，但不影响出血事件。
心房颤动是最常见的持续性心律失常，常常会导致患者发生脑卒中。为减少心房颤动患者血栓栓塞和脑卒中的发生，一般口服法华林或达比加群酯等抗凝剂。达比加群酯作为新型口服抗凝剂，可有效抑制关键凝血因子，阻碍血栓形成，预防心房颤动患者脑卒中发生。然而，达比加群酯在降低脑卒中风险的同时，也会增加出血风险。P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）是三磷酸腺苷结合盒转运载体蛋白（adenosinetriphosphate-bindingcassettetransporter,ABC）中最大的一个亚系，可以影响多种药物的吸收和代谢[1-2]。而达比加群酯作为P-gp的底物，其代谢水平很可能受到P-gp表达和活性的影响。P-gp的编码基因是ABCB1，ABCB1多态性（尤其是CT）可以影响P-gp的表达和活性[3]。本文主要研究了新疆维吾尔族（维族）心房颤动患者ABCB1基因CT多态性与达比加群酯治疗效果（包括血药浓度、治疗4d后凝血指标以及致出血风险）的关系。
1资料和方法
1.1一般资料
选取年1月至年12月在新疆医院住院或门诊就诊的心房颤动患者例作为研究对象，其中汉族患者93例（男47例、女46例），维族患者73例（男37例、女36例）。纳入标准：年龄≥18岁、CHADS2评分（表1）≥2分的非瓣膜性心房颤动患者。非瓣膜性心房颤动诊断标准：美国心脏协会（AHA）/美国心脏病学会（ACC）/美国心律学会（HRS）心房颤动指南定义为在不合并风湿性二尖瓣病变、机械或生物瓣膜置换术以及二尖瓣成形术的情况下而出现的心房颤动。记录患者年龄、身高、性别、体质量指数、体质量、出血事件及原发性高血压（高血压）、糖尿病、心力衰竭、脑卒中或短暂性脑缺血发作（Transientischemicattack,TIA）史和CHADS2评分等一般资料，见表1。遵循随机数字表法入选的患者随机分为维族心房颤动组和汉族心房颤动组。研究对象在试验前均签署知情同意书。
1.2ABCB1基因多态性检测方法
1.2.1血液标本采集及基因组DNA提取采集患者外周血5mL于0.01%乙二胺四乙酸抗凝试管中，-80℃冻存，用于DNA提取。DNA提取采用PAXgeneBloodDNA提取试剂盒（天根），经分光光度仪检测其浓度、纯度，用琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量及完整性的质检。
1.2.2基因型检测在UCSC、HapMap数据库中选择出ABCB1基因的标签单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNPs）（CT位点），利用PrimerPremier5.0设计跨ABCB1_CT位点的引物，进行聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）扩增。引物序列合成由北京擎科生物科技有限公司完成。
PCR反应体系50μL：ExTaqDNA聚合酶（5U·μL-1）0.5μL，10×PCRBuffer（Mg2+Plus）5μL，dNTPsMix4μL，模板DNA2μL，上游引物ABCB1-cx-F和下游引物ABCB1-cx-F（10pmol·μL-1）各2μL，灭菌超纯水34.5μL。反应循环参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min（表2），35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的片段切胶回收后送北京擎科生物科技有限公司测序。
根据测序获得的序列，找到其中的SNPs位点，设计两对特异引物靶向不同的位点，进行PCR扩增。PCR反应体系50μL：ExTaqDNA聚合酶（5U·μL-1）0.5μL，10×PCRBuffer（Mg2+Plus）5μL，dNTPsMix4μL，模板DNA2μL，两对特异引物（F-T、F-T和F-C、R-C）（10pmol·μL-1）各2μL，灭菌超纯水30.5μL。反应循环参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s（表2），35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3达比加群酯血药浓度检测
于患者服药3d后抽取外周抗凝血1mL，用液相色谱仪检测。用甲醇沉淀血浆蛋白，采用Kro-masilC18柱（mm×4.6mm,5μm），流动相为0.01mmol·L-1甲酸铵溶液-甲醇（77:23），流速为0.5mL·min-1。测晨起服药后2h和12h（晚间服药前）的血药浓度作为峰浓度和谷浓度。
1.4凝血指标检测
在SysmexCS5上检测维族心房颤动患者服用达比加群酯前和服用4d后的凝血指标，包括活化部分凝血酶时间（activatedpartialthromboplastintime,APTT）、凝血酶时间（thrombintime,TT）、凝血酶原时间（prothrombintime,PT）、国际标准化比值（Internationalnormalizedratio,INR）并记录相关数据。
1.5一般指标观察
所有入选患者均经知情同意后开始口服达比加群酯mg，一天2次治疗，在服药前、服药后4周、12周分别进行凝血功能、血常规及肝、肾功能检测，并观察患者服药后1年内发生全身栓塞及出血事件的情况。
1.6统计学分析
采用SPSS17.0统计软件进行数据处理。计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验。计量资料以（）表示，两组间采用t检验，多组间比较采用F检验。以P0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1汉族和维族患者基线资料比较
汉族与维族两组患者年龄、身高、性别、体质量指数、体质量、出血事件及高血压、糖尿病、心力衰竭、脑卒中或TIA史和CHADS2评分等一般资料比较，差异均无统计学意义（P0.05），见表3和表4。
2.2ABCB1基因型鉴定结果
使用跨ABCB1_CT位点的引物对患者基因组DNA进行PCR扩增，将PCR产物回收后进行测序。对患者基因组DNA进行PCR扩增用以检测ABCB1基因CT位点。琼脂糖凝胶电泳显示：CT型杂合子含有一条约bp的条带和一条约bp的条带；CC型纯合子含有一条约bp的条带；TT型纯合子含有一条约bp的条带。测序结果与琼脂糖凝胶电泳检测结果吻合（图1）。
2.3汉族和维族患者基因型及等位基因频率分布比较
汉族患者共93例，其中CT位点CC、CT、TT基因型分别为29例（31.2%）、46例（49.5%）、18例（19.3%）；C和T等位基因分别为例（55.9%）、82例（44.1%）；维族患者共73例，其中CT位点CC、CT、TT基因型分别为23例（31.5%）、36例（49.3%）、14例（19.2%）；C和T等位基因分别为82例（56.2%）、64例（43.8%）。维族和汉族两组患者中的CC、CT、TT基因型频率及等位基因频率比较，差异无统计学意义（P0.05），见表5。
2.4达比加群酯血药浓度与基因型的关系
将心房颤动患者按照CT位点基因型分为CC型组，TT型组和CT型组，分析比较不同基因型的维族心房颤动患者经相同剂量的达比加群酯治疗期间血药浓度的差异，结果表明，TT型组患者的血药峰浓度最高，CT型组次之，CC型组最低，方差分析表明三者总体差异具有极显著性（P0.），见表4。任意两组患者的血药峰浓度比较，差异均具有统计学意义（P0.），见图2。TT型组患者的血药谷浓度最高，CT型组次之，CC型组最低，方差分析表明三者总体差异具有极显著性（P0.），见表6。任意两组患者的血药谷浓度比较，差异有统计学意义（P0.），见图2。
2.5达比加群酯治疗前后凝血指标的比较
维族心房颤动患者服用达比加群酯后4d的凝血指标APTT[（35.11±5.10）svs.（29.94±1.58）s，P0.01]、TT[（80.28±44.44）svs.（18.82±1.50）s，P0.01]、PT[（12.55±1.03）svs.（11.21±0.96）s，P0.01]、INR（1.39±0.17vs.1.13±0.14，P0.01）比服用前显著升高，差异有统计学意义，见图3。
2.6不同基因型患者治疗前后凝血指标比较
不同基因型患者服用达比加群酯前APTT、TT、PT、INR比较，差异无统计学意义（P0.01），服用达比加群酯后APTT、TT、PT、INR均显著升高，差异有统计学意义（P0.01）。其中APTT和APTT变化率在TT型组中显著高于CT型组和CC型组，差异有统计学意义（P0.01）；TT和TT变化率在TT型组中显著高于CC型组，差异有统计学意义（P0.01）；而PT和PT变化率、INR和INR变化率在不同基因型患者中比较，差异无统计学意义（P0.05），见表7。
2.7达比加群酯治疗后出血事件与基因型的关系
分析比较ABCB1不同基因型的维族心房颤动患者在达比加群酯治疗期间的出血事件发生率，结果表明，CC、CT、TT基因型的心房颤动患者在达比加群酯治疗期间的出血事件发生率比较，差异无统计学意义[8.7%（2/23）vs.5.6%（2/36）vs.14.3%（2/14），P0.05]。
3结论
已有研究报道指出，在不同地区、不同民族ABCB1基因CT的分布频率有所不同[4]。本研究通过检测ABCB1基因CT多态性，比较了新疆地区汉族和维族心房颤动患者之间的差异，结果显示，汉族和维族心房颤动患者CT多态性比较，差异无统计学意义（P0.05）。本研究结果与文献中中国人在该位点的频率分布相符[4-5]。
ABCB1基因CT已被报道能够影响多种药物的血药浓度，如华法林、钙调磷酸酶抑制剂、他克莫司和利培酮等[7-10]。本研究比较了ABCB1基因CT不同基因型维族心房颤动患者达比加群酯治疗后血药浓度，结果显示，3种基因型患者的血药峰浓度和血药谷浓度均有显著差异，TT型最高，CC型最低。ABCB1基因编码P-gp，CT多态性虽然不改变P-gp的氨基酸序列，但是能够改变P-gp的表达和活性[11-12]。本研究中ABCB1基因CT很可能是通过影响P-gp的表达和（或）活性影响了达比加群酯的代谢，进而影响了患者体内达比加群酯的血药浓度。
本研究比较了ABCB1基因CT不同基因型维族心房颤动患者达比加群酯治疗后凝血指标，结果显示，3种基因型患者的APTT存在显著差异；CC型患者和TT型患者的TT存在显著差异；3种基因型患者的PT、INR差异不明显。有研究报导，达比加群酯血药浓度与APTT和TT存在线性正相关，而与PT不相关[13]。表明TT型患者的APTT和TT显著高于CC型患者可能是因为TT型患者达比加群酯血药浓度显著高于CC型患者。
出血事件是抗凝治疗的不良反应之一。本研究比较了ABCB1基因CT不同基因型维族心房颤动患者达比加群酯治疗后出血事件，结果显示，3种基因型患者中出血事件发生率比较，差异无统计学意义（P0.05）。说明ABCB1基因CT对维族心房颤动患者达比加群酯治疗后是否发生出血事件没有影响。
参考文献（略）
敬请
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